北京新冠状型肺炎_新冠肺炎 | 北京协和医院新型冠状病毒核酸检测流程是什么样的？

/北京协和医院感染内科副研究员编著/甘

搜狐健康]近日，北京协和医院响应国家卫生委员会的号召，作为北京市首个“新型冠状病毒”检测试点单位，发布了“新型冠状病毒核酸检测”标准操作流程培训视频该视频一经发布，就受到了医疗机构的广泛关注，为其核酸检测“新冠状病毒”提供了合理的规范和有益的参考为了进一步推进操作流程，促进疾病检测与诊断，北京协和医院感染性内科副研究员韩阳将对流程进行详细梳理，并以文字和视频的形式对流程进行全面分析。

●编制依据●

1。新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)<

2。新型冠状病毒感染肺炎实验室检测技术指南(第3版)<

3。新型冠状病毒感染肺炎防治计划(第3版)<

4《新型冠状病毒感染肺炎的诊断和治疗计划(第5版试验)》

●用途和适用范围说明●

1。在当前新型冠状病毒流行的形势下，需要进行核酸检测的医疗机构如何在有限的硬件条件下，科学、规范、有效地做好生物安全保护和核酸检测工作

2。每个实验室可以根据自己的条件和程序制定适当的生物安全保护和核酸检测方案。

3。此过程视频仅供参考

●检测流程●

(一)核酸检测前的生物安全防护(员工个人三级防护服)

1。穿戴流程:

在基因扩增实验室洁净区(穿戴区)或普通实验室洁净区，工作人员依次穿戴一次性帽子、医用N95口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防护目镜和双乳胶手套进入样品处理工作区或实验室

2。要点:

●具备标准基因扩增布局条件的实验室应在洁净着装区做好个人三级防护工作。条件有限的实验室也可以根据清洁实验室的程序选择穿戴个人3级防护。

●需要医用N95口罩。如果没有医用N95口罩，可以考虑普通N95/KN95口罩和一次性手术口罩的组合，但不需要带呼吸阀的N95口罩。

●佩戴N95口罩时要检查松紧度，并用双手按压、深呼吸、左右转动等方法严格检查口罩是否正确佩戴。

●一次性防护服已经满足新型冠状病毒核酸检测的防护要求。在条件允许的情况下，可以考虑一次性反穿隔离衣，穿隔离衣时需要其他人的帮助。

●穿戴整齐的工作人员应按要求尽快进入实验区进行样品处理工作。佩戴三级防护后，严禁进入公共实验区或办公区。

(2)样品

1的灭活处理，操作流程:

两名完成三级保护的工作人员进入样品处理区或专用实验室进行样品处理，打开安全柜内接收样品的二次包装，检查样品主容器是否密封；密封袋表面灭菌后，待检样品在56℃灭活30分钟。灭活样本管应在生物安全柜最里面的容器中打开，拭子保存液应混合均匀，然后分装，用于核酸提取。

2。要点:

●涉及高致病性微生物的实验室活动需要由两名工作人员完成，其中一人负责主要的实验操作，另一人提供必要的协助。主操作员应避免重复进出安全柜

●灭活形式:可采用水浴或空气加热完成灭活，采用空气加热可适当延长灭活时间当条件允许时，可以使用小型化设备在安全柜中操作，从而减少样品进出安全柜的次数。灭活前的样品严禁在生物安全柜外打开和操作。

●应特别检查取样管是否紧固，是否有样品溢出或泄漏。

●每次采样管进出安全柜时，必须对外表面进行消毒。

●应在附近提供适当的消毒物品，以防止实验操作期间意外溢出。当条件允许时，建议在安全柜中提供一次性吸水台布

(3)样本核酸提取

A，手动核酸提取程序(以凯蒂丝·弗林的52906柱提取核酸提取试剂盒为例)

(1)裂解物制备:在基因扩增实验室的试剂制备区或单独的普通试剂制备实验室，制备核酸提取所需的洗涤液1(AW1)、洗涤液2(AW2)和载体核糖核酸根据要求，将130毫升和160毫升分子生物学级无水乙醇分别加入洗液1和洗液2中，并及时标记。取310μl洗脱液溶解310μg/支载体核糖核酸配置完成后，通过传输窗口进入核酸提取区，或由工作人员送至专门的实验室进行核酸提取。

(2)样品裂解:将560μl AVL裂解液放入1.5ml无菌电生理试管中，加入5.6μl制备好的载体核糖核酸，然后加入140μl灭活样品(如咽拭子、血浆等)。)加入，混合均匀，振荡15秒，并在室温下静置10分钟，以完全溶解样品中的核酸极压管瞬时离心后，加入560μl无水乙醇，充分混合15秒，然后再次瞬时离心，备用吸收630μl溶胞产物，小心地将其添加到离心柱中，以8000rpm(或6000g)离心1分钟，将离心柱转移到新的收集管中，将剩余的630μl溶胞产物添加到离心柱中，并重复之前的离心操作(如果样品体积大于140μl，则在此步骤中在离心柱上重复过滤和收集630μl溶胞产物)

(3)核酸洗涤:将500μl洗涤溶液1(AW1)置于离心柱中，以8000rpm(或6000g)离心1分钟；更换收集管后，将500μl洗涤液2(AW2)放入离心柱，以8000转/分(或6000克)离心1分钟；更换收集管后，以14000转/分(或20000克)离心3分钟，以去除洗液2(AW2)；更换收集管后，继续以离心机的最大转速(20000g)离心1分钟，并完全丢弃残留的洗涤液2(AW2)

(4)核酸的洗脱和回收:取1.5毫升无菌电生理试管，放入离心柱，加入40 ~ 60微升洗脱液(ave)，室温放置1分钟，以8000转/分钟离心1分钟，回收核酸用于聚合酶链反应检测

2。要点:

●新鲜裂解物的制备应尽可能在特殊的清洁区域或单独的实验室进行

●用分子生物学级无水乙醇试剂制备

●向离心塔添加裂解产物和洗涤液时要非常小心。尝试将清洗头探入离心柱内部，并在管壁上取样。避免溢出和污染离心柱的密封环，这可能导致乙醇残留和抑制后续的聚合酶链反应。

●从离心机中取出离心柱时要小心，防止离心柱的下边缘被收集管中过滤后的残液污染

●加入洗液2(AW2)后的第二次空管全速离心非常关键，有助于充分分离离心柱滤膜中残留的洗液2残留物，保证洗脱核酸的纯度。

●添加洗脱液时应小心，确保洗脱液尽可能覆盖所有离心柱滤膜，以充分洗脱核酸并提高核酸提取的产量。

●手动核酸提取可优选使用检测试剂盒说明书中推荐的匹配手动提取试剂，也可使用通用手动提取试剂

●在样品处理过程中，工作人员需要时应更换新的外层乳胶手套。

B，核酸提取器提取核酸的操作流程

按照核酸提取器和试剂的说明准备提取试剂，取200μl样品，在机器上提取核酸，提取的核酸按要求回收以备后用

2。重要提示:

●不同的提取仪器和试剂可能有不同的提取效率。请严格按照提取试剂盒的说明进行核酸提取

●如果条件允许，可以考虑在安全柜中使用微型核酸提取器，以进一步加强生物安全保护。如果使用安全柜外的核酸提取器，必须做好生物安全保护和样品污染预防。

(4)聚合酶链反应体系的制备及模板添加

1。操作流程:

聚合酶链反应系统在基因扩增实验室的试剂制备区或单独的专用实验室制备根据试剂盒说明书的要求，试剂盒的不同成分(一般包括反应液、酶、引物等。)根据各自所需的体积量进行制备和混合，充分混合并离心，然后通过转移窗口转移到核酸提取和样品添加区，或者由专门人员从试剂制备实验室转移到用于核酸提取和样品添加的专门实验室。在添加样品的专用生物安全柜中，根据检测样品的数量，在每个反应管中设置分装系统，将样品核酸逐一添加到相应的反应管中，并将聚合酶链反应反应管密封；每批试验需要一个阳性对照和三个阴性对照。

2。重要提示:

●试剂制备必须严格在试剂制备区进行，或在单独清洁的专用实验室和安全柜中进行，以确保试剂不会被污染。

●应根据测试样品的数量合理配制试剂。每批试验应包括3个阴性对照和1个阳性对照的试剂。同时，还应考虑试剂分配过程中的正常损耗等消耗。

●样品添加可以在样品处理/核酸提取的同一分区或同一实验室进行，但如果条件允许，最好在单独的样品添加区进行样品添加，或至少使用一个特殊的安全柜。

●建议每次系统包装时更换新的吸头，以避免重复使用造成的体积误差和交叉污染。

●系统样品申请登记表的配置应确保样品申请过程的准确性

●聚合酶链反应封闭管套应特别小心，建议更换新手套，以防止手套和其他接触物带入管套的污染风险。

(5)车载检测和结果分析

1。操作流程:

在扩增区或专用扩增实验室，准备好的聚合酶链反应检测管应由专人取出。混合和离心后，应进行仔细的车载检测。扩增参数应根据试剂盒说明书进行设置，并分析解释结果。分析结果时，应仔细阅读试剂盒说明书，并根据试剂盒的灵敏度、检测方法和局限性等技术特征以及该批次的阴性质控结果，全面解读样品的检测结果。检测后，为了防止可能的扩增污染，扩增后的聚合酶链反应管严禁打开盖子或从扩增实验室拿走。应尽快将其密封在容器中，如可密封的塑料袋中，然后放入指定的专用医疗垃圾桶中进行进一步处理。

2。要点:

●由于基因扩增区存在污染风险，特殊扩增区应在单独的专用实验室建立或扩增，且必须与核酸提取和试剂制备区有严格的物理分离。

●不同作业区域的工作服不得混用，尤其是基因扩增区域的工作服。建议仅在扩增区域或扩增实验室使用。

●熟悉检测用聚合酶链反应仪器的基本性能和特点，能够客观分析和判断检测结果消毒处理后

(6)检测

1。操作流程:

(1)生物安全柜:样品核酸提取完成后，在安全柜内用75%的消毒酒精对外手套进行消毒，将外手套取出并丢弃在安全柜内的垃圾桶内小心存放和丢弃用过的一次性吸水台布，用0.5%~1%的有效氯消毒剂或75%的酒精擦拭安全柜中所有仪器的表面，如安全柜和移液器。安全柜内产生的新型冠状病毒相关医疗废物分三层包装后，转移至实验室专用医疗垃圾箱。打开紫外线灯照射生物安全柜30分钟以上。

(2)样品核酸提取工作人员实验室:在其他人协助下，用0.5%~1%的有效氯消毒剂或75%的酒精均匀喷洒内层手套、袖口、手臂和隔离衣后，外层通过隔离衣被拉回至新型冠状病毒的专用医疗垃圾箱进行高压处理

(3)样品处理实验室:用0.5%~1%有效氯消毒剂或75%酒精对实验室台面和地板进行消毒；打开紫外线灯对空间消毒30分钟以上

(4)工作人员脱下三级防护:在缓冲区戴上新的外手套，脱下护目镜，用75%酒精浸泡消毒，从上到下，从里到外慢慢翻身脱下一次性防护服，直至脱下所有一次性防水靴，将防护服放入新型冠状病毒高压治疗专用医用垃圾桶内。面具、帽子、内鞋套和内手套也放在一个特殊的医用垃圾桶里，用于新型冠状病毒的高压治疗。

(5)与新型冠状病毒相关的医疗废物:所有与新型冠状病毒相关的医疗废物经湿热高压灭菌后，应作为普通医疗废物处理，并在垃圾袋上标明新型冠状病毒医疗废物的相关信息高压处理前后的垃圾应严格区分。新型冠状病毒医疗垃圾应在高压灭菌专用区域进行湿热高压灭菌，高压参数为121℃30分钟。高压应该以物理和生物方式指示，以确保高压灭菌的效果。

2。重要提示:

●生物安全柜是风险最高的区域。消毒后，必须将操作员的外手套从安全柜中取出。

●靴子或鞋套主要用于保护操作者的脚和腿。它们必须是防水的，以确保在实验室意外溢出时隔离污染。

●核酸提取器、生物安全柜和实验室空间的内部应进行紫外线消毒。然而，紫外线对空气有很好的消毒效果，对物体表面的消毒效果随着距离的增加而降低。因此，在紫外线消毒前，各种仪器表面、工作台面和地板仍需用消毒剂擦拭消毒。

●脱去个人三级防护后，实验结束后，工作人员仍应按原实验室操作流程进行严格、认真的常规消毒处理，尤其是实验结束后的手卫生。