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"病原体2019-nCov可能是一种新型冠状病毒b"
编译:step shake < br>
编辑:tuya
产品:金融涂鸦
文章摘自《新英格兰医学杂志》2月20日发表的一篇论文
1，摘要
2年12月019日，中国武汉发生一起与海产品批发市场有关的不明原因肺炎病例。在对肺炎患者样本的全基因组测序后，发现了一种以前从未见过的贝塔冠状病毒属病毒。该病毒是从受感染者的呼吸道上皮细胞中分离出来的，随后被命名为2019-nCoV。它属于原冠状病毒亚科的萨贝冠状病毒亚属，但形成了另一簇进化分支。2019年的今天，与MERS-CoV和SARS-CoV不同，nCoV是能够感染人类的冠状病毒家族的第七个成员。目前正在加强对该病毒的监测和进一步研究(由中国国家重点研发项目和国家重大传染病防控项目资助)
新的和重新出现的病原体对全球公共卫生构成挑战冠状病毒是一种包膜核糖核酸病毒，广泛存在于人、哺乳动物和鸟类宿主中，可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。目前已知六种冠状病毒属对人类具有致病性，其中229E、OC43、NL63和HKU1是主要的冠状病毒属，它们可在免疫功能正常的宿主中导致常见的感冒症状。另外两种病毒，非典病毒和默斯病毒，引起人畜共患传染病，有时甚至致命疾病。传染性非典型肺炎是2002年至2003年在广东爆发的严重急性呼吸综合征(非典)的病原体，而中东呼吸系统综合征是2012年在中东爆发的严重呼吸系统疾病的病原体。由于冠状病毒的高度流行和广泛分布，其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组，以及人-动物接触活动的增加，由于频繁的跨物种感染和偶尔的动物-动物传播事件，新型冠状病毒可能周期性地出现在人类面前。
2年12月底，武汉市几个卫生机构报告了不明原因肺炎的聚集病例，这些病例在流行病学上与武汉市的一个海鲜和新鲜食品批发市场有关。12月31日，中国疾病预防控制中心派出快速反应小组，与湖北省和武汉市的卫生机构开展流行病学和病原学调查。我们在疫情早期报告了本次调查的结果，确定了肺炎聚集病例的来源，描述了中国疾病预防控制中心在肺炎患者中检测到的一种新型冠状病毒，并描述了其中2例患者的肺炎临床特征。
2，方法< br>
病毒诊断方法
4下呼吸道标本(包括支气管肺泡灌洗液)采集自2019年12月21日或之后在武汉发现的不明原因肺炎患者。这些患者在临床表现出现前不久曾去过华南海鲜市场从北京医院不明原因肺炎患者中采集7份支气管肺泡灌洗液作为对照我们根据制造商(罗氏)描述的方法，使用高纯度病毒核酸试剂盒从临床样品(包括未感染的培养物作为阴性对照)中提取核酸并根据制造商的说明，使用respifindersmart 22kt(路径索引仪bv)和LightCycler 480实时聚合酶链反应系统，使用聚合酶链式反应(聚合酶链反应)检测提取的核酸样品中的病毒和细菌核酸我们根据补充附录中详述的方法分析了样品中的22种病原体(18种病毒和4种细菌)。此外，我们使用上述全基因组高通量测序方法来寻找不能通过上述方法鉴定的微生物序列，并使用补充附录中描述的实时逆转录聚合酶链反应(RT-聚合酶链反应)方法通过靶向全β-CoV的共同RdRp区域来检测病毒核糖核酸。收集
病毒分离
支气管肺泡灌洗液样品，置于无菌杯中，并加入病毒转移培养基然后将样品离心除去细胞碎片将上清液接种到人气道上皮细胞上，所述人气道上皮细胞是从肺癌手术患者的气道样品中获得的，并经NGS确认不含特定病原体
人气道上皮细胞在塑料基质上扩增，培养产生一代细胞，然后接种在密度为每孔2.5×105个细胞的渗透性Transwell-COL(直径12 mm)支架上。在气液界面，人气道上皮细胞培养4 ~ 6周，形成分化良好的极化培养物，类似于体内假复层粘膜纤毛上皮感染前，人气道上皮细胞的顶面用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次。150.穆。将1升支气管肺泡灌洗液样品上清液接种到细胞培养物的顶面在37℃孵育后2小时，用500μl磷酸盐缓冲盐水冲洗10分钟以除去未结合的病毒；人气道上皮细胞保存在37℃和5%二氧化碳的气液界面每48小时将150 μL磷酸盐缓冲盐水添加到人气道上皮细胞的顶面，并在37℃孵育后收集样品。c . 10分钟假复层粘膜纤毛上皮细胞保存在这种环境中。将顶面样品转移到1: 3稀释的瓶装原液中，以生成新细胞每天，使用光学显微镜来监测细胞是否具有细胞病变效应，并且使用逆转录聚合酶链反应来监测上清液中是否存在病毒核酸。3代后，制备顶面样品和人气道上皮细胞用于透射电子显微镜检查。收集
透射电子显微镜检查
显示细胞病变作用的人气道上皮细胞培养物上清液，用2%多聚甲醛灭活至少2小时，并超速离心以沉淀病毒颗粒富集的上清液在涂层格栅上被阴性染色以供检查收集表现出细胞病变作用的人气道上皮细胞，用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，然后用1%四氧化锇固定，用梯度乙醇脱水，并嵌入PON812树脂将树脂块切片(80 nm)，分别用乙酸铀和柠檬酸铅染色透射电镜下观察阴性染色网片和超薄切片。
病毒基因组测序
克隆和测序基因组，使用从支气管肺泡灌洗液和培养物中提取的RNA作为模板我们使用Illumina测序和纳米孔测序方法来确定病毒基因组。CLC基因组学软件版本4.6.1 (CLC Bio)用于将序列读取长度组装成重叠群图(一组重叠的DNA片段)随后，设计了用于聚合酶链反应的特异性引物，并使用5’-或3’-RACE(cDNA末端快速扩增)来填充基因组的空白区域，用于常规的桑格测序。根据制造商的说明，从凝胶中纯化这些聚合酶链反应产物，并使用大染料终止子3.1循环测序试剂盒和3130XL基因分析仪进行测序。
使用肌肉对2019-nCoV和参考序列进行多序列比对使用RAxML(13)进行全基因组的系统发育分析，进行1000次自扩展复制，并建立通用时间可逆模型作为核苷酸替代模型。
3，结果
例患者
2 019年12月27日，武汉某医院收治3例成人重症肺炎患者患者1是一名49岁的女性。患者2是61岁的男性。患者3是一名32岁的男性我们收集了患者1和患者2的病史:患者1无慢性基础病史，但发热(体温37 ~ 38℃)、咳嗽和胸部不适症状于2019年12月23日开始出现。发病4天后，咳嗽和肺部不适症状恶化，但发热症状缓解。我们根据计算机断层扫描的结果作出肺炎的诊断病人的职业是海鲜批发市场的零售小贩。患者2抱怨发热和咳嗽的初始症状始于2019年12月20日，发作后第7天出现呼吸困难，第2天出现进行性加重(胸片见图1)。在此期间开始机械通气这位病人过去常去海鲜批发市场。患者1和患者3经过治疗后痊愈，并于2020年1月16日出院，但患者2于2020年1月9日死亡，且未从患者身上采集活检样本。
新型冠状病毒
|的检测与分离199 2年12月30日019，我们从武汉金印滩医院收集了这3例患者的肺泡灌洗液这些临床样本常规用respifendersmart-22试剂盒进行检测，但未发现特异性病原体(包括HCoV-229E、HCov-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。从支气管肺泡灌洗液中提取的核糖核酸被用作克隆基因组的模板，Illumina测序和纳米孔测序方法被结合用于测序。从单个样本中获得了超过20，000个病毒序列读取长度，并且大部分重叠与B冠状病毒属的B谱系相匹配，与先前发表的蝙蝠非典样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45，MG772933.1)基因组达到85%的一致性。我们对冠状病毒的核糖核酸共享区进行了实时逆转录聚合酶链反应检测，也获得了阳性结果(尽管检测样品的循环阈值高于34)人气道上皮细胞和Vero E6和Huh-7细胞系用于临床样品的病毒分离。分离出的病毒被命名为2019-nCoV
为了确定在被2019-nCoV感染的人气道上皮细胞中是否能观察到病毒颗粒，我们每天对被模拟感染和2019-nCoV感染的人气道上皮细胞培养物进行光学显微镜检查，并在培养6天后进行透射电镜检查接种后96小时，在人呼吸道上皮细胞表面观察到细胞病变效应。通过光学显微镜观察，在视野中心没有发现细胞纤毛运动(图2)然而，在用Vero E6和Huh-7细胞系培养6天后，没有观察到特定的细胞病变效应。2019-nCoV粒子通常是球形的，但是一些是多形性的，如通过负染色电子显微镜观察到的(图3)直径为60-140纳米病毒颗粒有明显的棘突，长9 ~ 12 nm，导致病毒颗粒呈冠状在人气道上皮的超薄切片中观察到细胞外游离病毒颗粒和充满病毒颗粒的包涵体。观察到的形态与冠状病毒科一致
为了进一步确定病毒的特征，我们使用Illumina和纳米孔测序方法对从患者临床样本(支气管肺泡灌洗液)和人气道上皮细胞分离的2019-nCoV进行基因组从头测序我们在所有3名患者中检测到新的冠状病毒我们从支气管肺泡灌洗液中获得了两个接近全长的冠状病毒序列(BetaCv/武汉/IVDC-HB-04/2020，BetaCv/武汉/IVDC-HB-05/2020 | EPI _ ISL _ 402121)，而全长病毒序列(BetaCv/武汉/IVDC-HB-01/2020 | EPI _ ISL _ 402119)是从一名患者分离的病毒中获得的这三种新型冠状病毒的全基因组序列已被报道到美国气体安全署网站(BetaCov/武汉/IVDC-HB-01/2019，登录号:EPI _ ISL _ 402119BetaCov/武汉/IVDC-HB-04/2020，登录号:epi _ isl _ 402120BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019，登录号:epi _ ISL _ 402121)，核苷酸序列与先前发表的蝙蝠传染性非典型肺炎样冠状病毒(蝙蝠-S1-CovzC 45，MG772933.1)基因组一致86.9%这3个2019-nCoV基因组聚合形成了Sarbe冠状病毒亚属的一个独立分支，显示了b型冠状病毒的典型结构:一个5’非翻译区(UTR)，复制酶复合物(orf1ab)，s基因，e基因，m基因，n基因，3’UTR和几个未识别的非结构开放阅读框
尽管2019-nCov与在蝙蝠中检测到的某些B冠状病毒相似(图4)，但它明显不同于“非典”病毒和“中东呼吸综合征”病毒来自武汉的3株2019-nCoV冠状病毒与来自蝙蝠的2株类非典病毒ZC45和ZXC21形成一个新的分支。来自人体的传染性非典型肺炎冠状病毒株和从中国西南地区蝙蝠中分离出的类传染性非典型肺炎冠状病毒构成了沙贝冠状病毒亚属的另一个分支2019年的今天，在保守的复制酶区(ORF 1ab)，nCoV和B属冠状病毒的其他成员没有达到90%的序列一致性。因此，2019-nCov是一种新的B型冠状病毒，属于冠状病毒科的Sarbe冠状病毒亚属，可能是武汉病毒性肺炎的病原。
4。讨论
我们报告了2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中发现的一种新型冠状病毒(2019-nCoV)病毒存在的证据包括通过全基因组测序、直接聚合酶链反应和培养方法鉴定3名患者支气管肺泡灌洗液中的病毒。这种可能由冠状病毒引起的疾病被命名为“新型冠状病毒感染的肺炎”(NCIP)，完整的基因组已提交给美国气体援助组织网站系统发育分析表明，2019-nCoV属于冠状病毒B属；冠状病毒B属包括冠状病毒(非典冠状病毒，蝙蝠非典样冠状病毒等。)在人类、蝙蝠和其他野生动物中发现。我们报道了该病毒的分离，并描述了其特定的细胞病变效应和形态学。
多年来，分子技术已被成功地应用于确定传染源。全基因组高通量测序是发现病原体的有力工具。第二代测序和生物信息学正在改变我们处理传染病爆发的方式，提高我们对疾病发生和传播的理解，加速病原体的识别和促进数据共享。在这篇文章中，我们描述了一种通过分子技术和全基因组测序发现的新型冠状病毒，它可能是中国武汉3例重症肺炎病例的罪魁祸首。
虽然建立人呼吸道上皮细胞的培养方法是一项费时费力的工作，但它是分析人呼吸道病原体的重要研究工具我们的研究表明，通过首先在人气道上皮细胞培养物上增殖呼吸道分泌物，然后用透射电子显微镜和全基因测序方法分析培养物上清液，成功地观察和检测了人冠状病毒，这在传统方法中是不可能的。
我们还需要进一步建立一种能够准确、快速鉴定呼吸道未知病原体的方法基于在本研究中获得的三个完整基因组，我们设计了几种特异性和敏感性的检测方法，用于检测2019-nCoV基因组中的ORF1ab、n和e区，以检测临床样本中的病毒核糖核酸。已经与世界卫生组织分享了用于在全球和中国监测和检测2019年非传染性肝炎病毒感染的引物组和标准操作程序。最新数据显示，在中国已有830人检测到2019-nCoV。
虽然这项研究没有完全遵循科赫定律，但我们的分析提供了2019年武汉暴发-非传染性肝炎的证据我们还需要提供与2019-nCoV在武汉造成的疫情有关的其他证据，包括用免疫组织化学方法检测患者肺组织中的2019-nCoV抗原，在两个时间点检测同一患者血清样本中的抗病毒IgM和IgG抗体，以及动物(猴)实验的致病证据。有必要开展流行病学调查，以确定感染的传播方式、生殖间隔和感染的临床症状谱，从而指导我们制定预防、控制和阻止2019-nCoV传播的策略。
(来自中国疾病预防控制中心国家疾病预防控制中心NHC生物安全重点实验室(新西兰、世界卫生组织、日本、日本、新西兰、英国、荷兰、法国、荷兰、德国、德国、WX、德国、美国、GFG、英国)，首都医科大学附属北京地坛医院传染科；武汉金印滩医院、湖北省疾病预防控制中心病毒病检测部、中国科学院生物安全大科学中心、山东第一医科大学和山东省医学科学院)
