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这篇文章发表在1月24日的《新英格兰医学杂志》上，作者是
作者|高福(中国科学院院士，中国疾病预防控制中心主任)
[摘要]2年12月，一群不明原因的肺炎患者被发现与中国武汉的一个海产品批发市场有关一种以前未知的亚冠状病毒(β-回旋病毒)是通过对肺炎患者样本进行无偏测序而发现的。人类呼吸道上皮细胞被用来分离一种新的冠状病毒，命名为2019-nCoV，它形成了原冠状病毒亚科的一个分支与MERS-CoV和SARS-CoV不同，2019-nCoV是感染人类的冠状病毒家族的第七个成员。正在加强监测和进一步调查。(由国家重点研发项目和国家重点传染病防治项目资助)
新出现和再出现的病原体是对公共卫生的全球性挑战冠状病毒是一种广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类的包膜核糖核酸病毒，可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。已知六种冠状病毒会导致人类疾病。四种病毒-229E、OC43、NL63和HKU1-在具有免疫能力的个体中是常见的，并且通常引起普通感冒症状。另外两种毒株——严重急性呼吸综合征冠状病毒(非典冠状病毒)和中东呼吸综合征冠状病毒(中东呼吸综合征冠状病毒)——最初是人畜共患的，有时与致命疾病有关。传染性非典型肺炎是2002年和2003年广东省爆发的传染性非典型肺炎的病原体中东呼吸道综合征是2012年中东地区严重呼吸道疾病的病原体鉴于冠状病毒的高度流行和广泛分布，其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组，以及人-动物界面活性的增加，由于频繁的跨物种感染和偶尔的溢出事件，新的冠状病毒可能周期性地在人类中出现。
2019年12月下旬，几个地方卫生机构报告了一群不明原因肺炎患者，他们与中国湖北省武汉市的海鲜和湿动物批发市场有关。2019年12月31日，中国疾病预防控制中心派出快速反应小组，陪同湖北省和武汉市卫生部门开展流行病学和病原学调查。我们报告了本次调查的结果，确定了肺炎群的来源，并描述了在肺炎患者中检测到的一种新的冠状病毒，其标本是由中国疾病预防控制中心在疫情早期检测到的。我们还描述了两例肺炎的临床特征
[研究方法]病毒诊断方法
收集2019年12月21日或之后在武汉确诊的不明原因肺炎患者的下呼吸道样本4份，包括支气管肺泡灌洗液，这些患者在临床表现接近时出现在华南海产品市场。收集北京医院7例已知原因肺炎患者的支气管肺泡灌洗液标本作为对照。根据制造商(罗氏)的描述，从临床样品(包括作为阴性对照的未感染培养物)中提取核酸需要使用高纯度病毒核酸试剂盒。提取的核酸样品根据制造商的说明，采用聚合酶链式反应(聚合酶链式反应)进行病毒和细菌检测，使用的是RespifinderSmart 22kt(病理检测器BV)和LightCycler 480实时聚合酶链反应系统。样本分析了22种病原体(18种病毒和4种细菌)，详见附录。此外，先前描述的无偏、高通量测序被用于寻找不能通过上述方法鉴定的微生物序列。实时逆转录聚合酶链反应(rt-PCR)检测用于检测病毒核酸。如补充附录中所述，β-CoV RdRp区域通过了目标共识。
病毒分离/筛选方法从支气管肺泡灌洗液样品中收集
分离的病毒，置于无菌杯中，加入病毒载体然后将样品离心除去细胞碎片将上清液接种到人气道上皮细胞上，所述人气道上皮细胞是从肺癌患者手术取出的气道标本中获得的，并经NGS证实不含特定病原体
将人气道上皮细胞扩增到塑料基质上以产生通道-1细胞，然后以每孔2.5-105个细胞的密度铺板在可渗透的Transwell-COL(直径12 mm)支架上人气道上皮细胞在气液界面培养4-6周，形成分化良好的极化培养物，类似体内假复层粘液上皮在
感染之前，人呼吸道上皮细胞的顶面用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将150μl支气管肺泡灌洗液样品上清液接种于细胞培养物的顶面。在37℃孵育2小时后，通过用500μl磷酸盐缓冲盐水冲洗10分钟，将人呼吸上皮细胞保持在37℃和5%二氧化碳的气液界面中。每隔48小时，将150μl磷酸盐缓冲液应用于人气道上皮细胞的顶面，并在37℃孵育10分钟后收集样品。假复层粘液上皮细胞在这种环境中得以维持。根尖标本在1∶3稀释烧瓶中传代培养至新细胞每天用光镜观察细胞病变，用逆转录聚合酶链反应检测上清液中是否存在病毒核酸。三代后，制备根尖标本和人气道上皮细胞用于透射电镜观察。
透射电子显微镜
收集具有细胞病变作用的人气道上皮细胞培养物的上清液，用2%多聚甲醛灭活至少2小时，并超速离心以沉淀病毒颗粒浓缩的上清液通过涂覆的网上的阴性染色来检测收集具有细胞病变作用的人气道上皮细胞，用2%甲醛-2.5%戊二醛固定，用1%四氧化锇脱水，用嵌有等级乙醇的PON812树脂固定从树脂块上切下切片(80纳米)，分别用醋酸铀酰和柠檬酸铅(醋酸铀酰和柠檬酸铅)染色透射电镜下观察阴性染色网格和超薄切片。
病毒基因组测序
使用从支气管肺泡灌洗液和培养上清液中提取的RNA作为基因组克隆和测序的模板我们使用Illumina测序和纳米孔测序来描述病毒基因组。使用CLC基因组学软件版本4.6.1 (CLC Bio)，将序列序列组装成重叠群图(一组重叠的DNA片段)随后，为聚合酶链反应设计了特异性引物，并使用5’-或3’-小种(快速扩增cDNA末端)来填补常规桑格测序的基因组空白。从凝胶中纯化这些聚合酶链反应产物，并根据制造商的说明使用大染料终止子3.1循环测序试剂盒和3130XL基因分析仪进行测序。使用肌肉对2019-nCoV和参考序列进行多序列比对使用RAxML(13)进行了全基因组的系统发育分析，进行了1000次自举复制，并建立了通用时间可逆模型作为核苷酸替代模型。
[结论]例患者
2年12月27日，019武汉某医院收治3例成人重症肺炎患者患者1为49岁女性，患者2为61岁男性，患者3为32岁男性。临床数据可用于患者1和2患者1报告没有潜在的慢性病，但在2019年12月23日出现发热(体温，37℃至38℃)和咳嗽并伴有胸部不适。发病四天后，她的咳嗽和胸部不适加重，但她的发烧减轻了。肺炎的诊断是基于计算机断层扫描她在海鲜批发市场做零售商。患者2最初于2019年12月20日报告发热和咳嗽；呼吸窘迫发生在疾病发作后7天，并在随后的2天内恶化(见胸片，图1)。此时开始机械通气他是海鲜批发市场的常客。患者1和3于2020年1月16日康复出院患者2于2020年1月9日死亡未获得活检标本。
的检测和分离1992年12月30日在武汉金印滩医院采集了一种新的冠状病毒
| 3支气管肺泡灌洗标本在这些患者的临床标本中未检测到特异性病原体(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。以患者支气管肺泡灌洗液中提取的核糖核酸为模板，结合Illumina测序和纳米孔测序，克隆基因组并测序。从单个样本中获得了20，000多个病毒片段，并且大多数簇与来自β冠状病毒属的B系的基因组相匹配——显示出与先前公布的蝙蝠传染性非典型肺炎样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45，MG772933.1)基因组的一致性超过85%。用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测了以泛β-CoV为靶点的核糖核酸的RdRp区(虽然检测样品的循环阈值高于34)，也获得了阳性结果。从人呼吸道上皮细胞和Vero E6和Huh-7细胞系中分离出病毒。分离出的病毒被称为2019- nCoV为了确定是否在2019年感染了nCoV的人气道上皮细胞中可以看到病毒颗粒，在接种后6天，每天用光学显微镜和透射电子显微镜检查2019年感染了模拟感染和nCoV的人气道上皮细胞培养物。接种后96小时观察人气道上皮细胞表面层的细胞病变效应。在病变的中心光学显微镜下可以看到纤毛脉动的缺失(图2)接种后6天，Vero E6和Huh-7细胞系没有观察到特定的细胞病变效应2019年负染的nCoV粒子
的电子显微照片通常是球形的，带有一些多形性(图3)直径从60纳米到140纳米不等。病毒粒子有非常独特的尖峰，大约9到12纳米，使得病毒粒子看起来像日冕。在人气道上皮的超薄切片中，可以看到细胞质膜结合囊泡中的细胞外游离病毒颗粒和充满病毒颗粒的包涵体观察到的形态与冠状病毒科一致
为了进一步鉴定该病毒，通过Illumina和纳米孔测序从临床标本(支气管肺泡灌洗液)和人呼吸道上皮细胞病毒分离株中获得2019年nCoV基因组从头序列。新的冠状病毒是从三个病人身上鉴定出来的。从支气管肺泡灌洗液中获得了两个接近全长的冠状病毒序列(BetaCv/周桓/IVDC-HB-04/2020，BetaCv/周桓/IVDC-HB-05/2020，EPI-ISL-u402121)，从从患者分离的病毒中获得了一个全长序列(BetaCv/周桓/IVDC-HB-01/2020，EPI-ISL-u402119)
向gisaid提交了三种新冠状病毒的全基因组序列(beta cov/武汉/ivdc-hb-01/2019，添加id:epi _ ISL _ 402119；BetaCov/武汉/IVDC-HB-04/2020，地址:epi _ isl _ 402120BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019，添加了编号EPI_ISL_402121，与之前发表的蝙蝠传染性非典型肺炎样冠状病毒(蝙蝠-S1-CovzC 45，MG772933.1)基因组具有86.9%的核苷酸序列同源性这三个2019-nCoV基因组聚集在萨贝切夫亚属中，显示了典型的锥虫病毒组织:5个非翻译区(UTR)、复制酶复合物(orf1ab)、s基因、e基因、m基因、n基因、3个UTR和几个未识别的非结构化开放阅读框
尽管2019-nCoV类似于在蝙蝠体内检测到的一些β-回旋病毒(图4)，但它不同于非典-CoV和中东呼吸综合征-CoV来自武汉的3株2019-nCoV冠状病毒与两株蝙蝠源非典样病毒ZC45和ZXC21形成明显的分支人传染性非典型肺炎冠状病毒株和中国西南地区蝙蝠的类传染性非典型肺炎冠状病毒在萨贝病毒亚属中形成了另一个分支由于2019-nCoV在保守的复制酶结构域(ORF 1ab)中与β冠状病毒的其他成员具有小于90%的序列同源性，2019-nCoV是武汉地区病毒性肺炎的可能致病因子，并且是属于冠状病毒科萨贝病毒亚属的新的β冠状病毒。
[讨论]我们报告了2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中发现的一种新的CoV(2019- nCoV)病毒存在的证据包括通过全基因组测序、直接聚合酶链反应和培养在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定。这种可能由这种冠状病毒引起的疾病被称为“新冠状病毒感染性肺炎”(NCIP)完整的基因组已提交给GISAID。系统发育分析表明，2019-nCoV属于甜菜夜蛾属，包括冠状病毒(非典-CoV、蝙蝠非典-CoV等)。)在人类、蝙蝠和其他野生动物中发现。我们报道了病毒的分离及其特定的细胞病变效应和形态学的初步描述。
199年以来，分子技术已被成功地用于识别传染源毫无疑问，高通量测序是发现病原体的有力工具。下一代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病爆发的方式，提高我们对疾病发生和传播的理解，加快病原体识别和促进数据共享。在这篇报道中，我们描述了通过分子技术和无偏倚的DNA测序发现的一种新的β-轮状病毒，它可能是中国武汉3例重症肺炎患者的病因。尽管建立人呼吸道上皮细胞培养物是劳动密集型的，但它们似乎是分析人呼吸道病原体的有价值的研究工具。我们的研究表明，呼吸道分泌物最初在人气道上皮细胞培养物上增殖，然后培养物上清液的全基因组测序和透射电子显微镜被成功地用于观察和检测新的人冠状病毒，这可能是传统方法不能识别的。
仍需进一步开发准确、快速的方法来鉴定未知的呼吸道病原体基于对本研究中获得的三个完整基因组的分析，我们设计了几个针对2019-nCoV基因组ORF1ab、n和e区的特异性和敏感性分析，以检测临床标本中的病毒核糖核酸。这些引物和标准操作程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019年非传染性肝炎病毒感染。最近的数据显示，2019年，中国有830人检测到了非传染性肝炎病毒
虽然我们的研究不符合科赫的假设，但我们的分析提供了2019-nCoV与武汉疫情相关的证据其他证实2019-nCoV在武汉疫情中致病意义的证据包括通过免疫组化分析鉴定患者肺组织中的2019-nCoV抗原，在两个时间点检测患者血清样本中的IgM和IgG抗病毒抗体以证明血清转化，以及动物(猴)实验以提供致病证据。有必要开展流行病学调查，以确定感染引起的传播方式、生殖间隔和临床谱，为制定预防、控制和制止2019-nCoV传播的策略提供信息和改进。
由国家重点研发项目(2016YFD0500101)和国家重大传染病防治项目(2018ZX1001002)资助本文全文可在NEJM.org
199位作者提供的公共表格上找到。朱博士、张博士、王博士、李博士、杨博士对本文作出了相同的贡献。
本文发表于2020年1月24日，并于2020年1月29日在NEJM.org更新
感谢李中杰博士、何光学博士、兰斯·罗德瓦尔德博士、博士、李钊博士、周为民博士、博士、博士、博士以及中国疾病预防控制中心的许多工作人员，感谢他们为初稿的编写和提交所做的贡献和帮助。
[第一作者单位]
国家病毒性疾病预防控制中心生物安全重点实验室，中国疾病预防控制中心，
北京首都医科大学传染科，地坛医院；
湖北省疾病预防控制中心，
中国科学院生物安全特大型科学中心，
湖北省疾病预防控制中心，武汉金印滩医院；
山东第一医科大学和山东省医学科学院，山东济南(西南)
中国疾病预防控制中心国家病毒性疾病预防控制研究所生物安全重点实验室谭博士、高博士、吴博士
编辑:王振强