手机网站
手机网站
摘要:本研究以从中国第一次非洲猪瘟流行中分离出的流行株SY18为亲本，构建了一株具有多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株。研究了基因缺失菌株的安全性和免疫保护作用。结果表明，MGF和CD2v双基因缺失株对猪是安全的。接种的猪对亲本菌株SY18的攻击有100%的抵抗力，所有对照猪都死亡。
关键词:非洲猪瘟病毒；基因缺失；疫苗候选菌株；安全；免疫保护
非洲猪瘟(ASF)是由ASFV (ASFV)非洲猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热、高传染性传染病。家猪的死亡率可高达这种疾病于1921年在肯尼亚首次被发现。它在20世纪50年代从非洲传播到欧洲。20世纪90年代在欧洲被消灭后，2007年又从东非蔓延到东欧国家格鲁吉亚。此后，该疾病在东欧广泛传播，并于2017年蔓延至俄罗斯伊尔库斯克地区。目前，ASF分布或爆发在50多个国家。2018年8月初，中国首次报告了非洲猪瘟疫情中国是世界上养猪和猪肉消费最多的国家，养殖密度高，养殖总量大。猪的年人口为6亿，占世界猪总人口的50%。然而，中国生猪养殖水平参差不齐，相关产业如养殖场存在许多生物安全漏洞。因此，ASF在传入中国后迅速传播开来。到目前为止，已经有31个省市的疫情报告。防控形势严峻复杂。由于猪瘟会对养猪业造成毁灭性打击，对非洲猪瘟疫苗的研究从未停止过。然而，由于ASFV的结构复杂，病毒感染和免疫机制尚不清楚，虽然ASF疫苗的研究始于20世纪60年代末，近年来已有报道，但尚未在实践中成功应用。到目前为止，国际上已经通过基因工程方法获得了许多ASFV基因缺失疫苗候选菌株，并且通过细胞传代弱化和从自然界分离减毒菌株获得了减毒疫苗候选菌株。一些疫苗候选株对同源病毒株的保护率为50%~100%，但对异源病毒的保护效果不理想。
此外，人工基因缺失减毒株和自然缺失减毒株在免疫猪后均有剂量依赖性副作用，免疫猪出现精神抑郁、食欲不振、发热、病毒血症、高丙种球蛋白血症、肺炎、关节肿胀、跛行、慢性病变、冻猪等，降低了疫苗的实际使用价值尽管人工基因缺失菌株具有良好的免疫标记，但关于基因缺失疫苗的报道却很少。目前，人们普遍关注非洲猪瘟基因缺失株和天然减毒株作为疫苗的安全性由于各种原因，我国对非洲猪瘟疫苗的研究和储备严重滞后。非洲猪瘟爆发后，非洲猪瘟疫苗的研究再次提上日程。尽管据国外报道，中国许多传染病学者对非洲猪瘟疫苗的研究和应用表示担忧甚至怀疑，但中国目前的形势决定了中国在现阶段应该采取疫苗免疫防控路线。
ASFV基因组大，长160-190 kb，编码160多种蛋白质，其中50多种是结构蛋白病毒编码的许多蛋白质成分具有免疫抑制特性，但通过比较和分析天然减毒株(包括CD2v、MGF、9GL等)的基因组序列，仅确认了少数与免疫抑制相关的基因。在已报道的天然减毒株和构建的基因缺失株中，对MGF和CD2v基因缺失株的研究较多。在本研究中，利用中国首次报道的病毒分离株SY18株，首次构建了三种MGF和CD2v单基因缺失、MGF和CD2V双基因缺失的重组病毒动物安全性和免疫效果试验证明，MGF基因单缺失、MGF和CD2v基因双缺失的菌株对免疫猪既具有良好的安全性，又具有良好的抗病毒保护效果。相关研究结果如下:
首次构建了同源重组质粒侧接1200bp序列的CD2v和MGF基因作为同源重组质粒的同源臂从ASFV流行株SY18的基因组中扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆在CD2v的两个侧翼片段之间，红色荧光蛋白(RFP)基因表达框架克隆在MGF的两个侧翼片段中
后，重组病毒被拯救和纯化将两者的同源重组质粒(2μg)转染入猪原代肺泡巨噬细胞培养物(约105个细胞)的6孔细胞培养板中，4小时后感染SY18菌株(1 MOI)，48小时后挑出荧光细胞(含重组病毒)，分别用三轮有限稀释法纯化筛选，获得ASFV SY18δCD2v、ASFV SY18δMGF和ASFVSY 18δMGF/δCD2v三种基因缺失病毒。获救重组病毒的聚合酶链反应鉴定、序列分析和纯度检测证明，我们成功获得了CD2v和MGF单碱基缺失病毒株(ASFV SY18δCD2v和ASFVY 18δMGF)和两碱基缺失病毒株(ASFVY 18δMGF/δCD2v)总体病毒构建策略如图1所示。
最终进行了重组病毒特性的研究将35头健康猪分为7组，分别接种2剂3株病毒。具体接种方案见表1。256±2-
记录了7组猪的体温和临床表现，并对免疫猪的血液、粪便和唾液进行了ASFV核酸聚合酶链反应结果表明，接种ASFV SY18δCD2v株后第二天，第1组和第2组猪体温升高，达到42℃以上，均在3 ~ 5d内死亡。这表明CD2v单基因的缺失不会显著削弱病毒的毒力。这与国外文献报道的结果不一致。第三组猪接种1 ~ 3d TCID50 ASFV SY18δMGF后，第二天部分猪体温开始上升，持续1 ~ 3天，但不超过41.3℃，然后恢复正常。后期未发现体温异常，观察期精神状态正常，摄入量未出现异常。第4组，接种104 TCID50 ASFV SY18δMGF猪，体温在40.2~41.3℃范围内升高8~13天，然后恢复正常，未发现精神抑郁或摄食量减少等临床症状。第5组和第6组猪分别接种ASFV SY18δMGF/δCD2v 103 CID50和104TCID50后，体温仅在1 ~ 2天内升高，体温低于40.5℃，体温恢复正常，摄入和精神状态无异常。结果表明，MGF基因的缺失可以显著降低ASFV的毒性，这与国外的研究结果一致:基于MGF基因缺失的CD2v基因的进一步缺失可以显著降低ASFV因MGF基因简单缺失而引起的长期发热反应，进一步提高安全性。观察期间采集的血液、粪便和唾液的ASFV核酸检测结果显示，血液和唾液中偶尔会检测到病毒核酸，粪便中的检测结果为阴性。对第3、5和6组的
对5头猪免疫28天，用第7组的5头对照猪用ASFVSY18强毒株进行抗病毒试验。抗病毒方法为口服，抗病毒剂量为103TCID50。观察持续了35天。结果，第3组、第5组和第6组的免疫猪得到完全保护，观察期间检测到的体温在正常范围内，没有任何异常的临床表现。对照组5头猪全部患病，均在42℃以上高烧持续2 ~ 7天后死亡。结果表明，ASF vsy 18δMGF/δCD2v不仅具有良好的安全性，而且具有良好的抗病毒保护作用，可作为ASF预防疫苗的良好候选。
ASF是OIE规定的应报告动物传染病，在中国被列为传染病类别自2018年8月初以来，我国31个省、市、区以及越南、蒙古、朝鲜和老挝都向OIE通报了严重的禽流感疫情。在控制猪瘟传染源、切断传播途径、保护易感动物等生物安全措施不充分有效的现状下，开发安全有效的疫苗、保障生猪供应是我国生猪养殖亟待解决的问题。虽然疫苗的使用可能纵容传染源的存在，放宽传播途径的切断，甚至在很大程度上对消灭猪瘟构成严重挑战，但从确保生猪供应、解决国民经济和民生的角度来看，在目前缺乏有效手段防止猪瘟传播的情况下，在可控范围内使用疫苗可能是无奈且唯一有效的选择。本研究采用基因工程方法构建了ASFV毒力基因缺失株，并对其免疫效果和动物安全性进行了初步评价。结果表明，用MGF单基因和MGF、CD2v双基因缺失免疫的猪对ASFV毒力攻击具有完全的保护作用，可作为非洲猪瘟疫苗在中国的候选菌株，值得进一步研究和探索。目前，世界上许多学者对非洲猪瘟疫苗的开发持怀疑甚至反对态度。这主要是因为ASFV不能诱导身体产生中和抗体。在猪的免疫保护条件下，强毒病毒仍能感染并产生病毒血症。研究证实，ASFV自然减毒株会对试验猪造成严重的副作用，并且更有可能出现新的变异和流行病。因此，疫苗的使用确实不利于消除非洲猪瘟。非洲猪瘟疫苗有必要进一步提高候选疫苗株的安全性，扩大疫苗效力的评价范围，进行长期的生物安全评价。
报道了多种ASFV毒力相关基因。在这项研究中，只有国际上广泛报道的MGF和CD2v基因被选为缺失靶。我们的结果表明，CD2v基因的单次缺失对病毒毒力的影响有限，而MGF基因(包括3个MGF505基因和3个MGF360基因)的缺失尽管在大剂量免疫后引起了长期的体温升高，但并不影响身体的精神状态和食物摄入。在低剂量免疫中，长期发热现象消失了在MGF缺失的基础上进一步缺失CD2v基因后，病毒接种引起的长期发热基本消除，这表明虽然CD2v单基因缺失株毒力很强，但CD2v基因缺失可以进一步降低MGF缺失株的毒力。
非洲猪瘟疫苗未来研究的重要方向
虽然我们构建的ASFV双基因缺失疫苗具有良好的安全性和免疫保护效果，但由于ASFV的复杂结构，病毒感染和免疫机制尚未完全确定，ASFV生产的抗体不具有中和活性，长期使用的ASFVSY 18δMGF/δCD2v的安全性和免疫持续时间需要进一步评价。从安全性角度来看，ASFV亚单位疫苗和病毒载体疫苗的研究也将是非洲猪瘟疫苗未来研究的重要方向。
