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昨天，2019年诺贝尔生理医学奖宣布了。三名发现细胞感知和氧气适应机制的科学家获得了该奖项，其中两名来自美国，一名来自英国。
诺贝尔奖正式提供的五个核心文件中，有一篇关于克隆缺氧诱导因子蛋白的文章。第一位作者是中国学者王广亮。
王广亮出生于1963年10月10日。1983年毕业于杭州大学生物系，1986年毕业于中国科学院细胞科学研究所，1991年毕业于亚利桑那州立大学，1992年至1995年在约翰·霍普金斯大学格雷格·塞门扎实验室从事博士后研究。他在1995年克隆缺氧诱导因子的工作为2019年诺贝尔生理医学奖的授予奠定了重要基础。
王广亮现在为美国大冢制药公司工作，从事新药研发。
北京时间2019年10月7日晚8点，知识分子采访了王广亮，要求他介绍这项工作的过程以及缺氧诱导因子发现的重要影响。
以下是独家采访。为了简洁起见，对文本进行了编辑。
采访/陈晓雪
氧气不仅为生命提供能量
知识分子:好老师王。在诺贝尔生理学或医学奖获得者格雷格·塞门扎教授的工作中，1995年的PNAS论文是关键文件之一。你是第一作者。你能介绍一下这篇论文的主要研究内容和你在塞门扎教授实验室做博士后的经历吗？
王广亮:1991年底，在我的医生毕业后，我去霍普金斯大学做博士后，研究细胞如何感受氧浓度和改变生理代谢功能。氧气与细胞能量代谢密切相关。然而，氧气的作用不限于向细胞提供能量。进化过程中形成的许多生理功能实际上是由氧气调节的。
例如，在氧气供应不足的情况下，作为一种反馈机制，身体会增加红细胞的数量以增加氧气供应。这种补偿机制是氧气作为调节信号的一个例子。缺氧信号可诱导红细胞生成素的产生，从而促进骨髓造血系统增加红细胞分化。目前，中国市场上已经有一种叫做罗莎·西塔(Rosa Sita)的药物，它通过稳定缺氧诱导因子来治疗贫血。这种药物是中国历史上批准的第一种新药，由一家美国公司生产。
我在霍普金斯大学做的第一个研究项目是研究细胞如何感受缺氧环境，从而增加促红细胞生成素基因的转录和表达。
首先，我们在实验室的细胞培养箱中输入低浓度的氧来模拟缺氧环境，找到红细胞生成素基因感知氧浓度的关键序列，即转录增强子。如果序列的这一部分被删除或突变，促红细胞生成素感知氧浓度的能力将下降。接下来，我们将寻找与转录增强子结合的转录因子。然而，细胞中转录因子的数量非常少。当时，我们的工作量很大，为了通过该柱筛选活性蛋白因子，在培养罐中培养了大量的人Hela细胞系。最关键的方法之一是用促红细胞生成素基因增强子序列制作亲和柱，筛选能结合和调节促红细胞生成素基因表达的转录因子。最后，从数百升细胞悬液中获得几毫克的缺氧诱导因子蛋白，用蛋白酶将其切割成小片段进行蛋白测序，根据获得的氨基酸序列推导出核酸序列，设计出推导出的核酸序列作为探针，将缺氧诱导因子基因捕获到基因库中，最终完成缺氧诱导因子基因的克隆。花了一年多的时间。
成功克隆缺氧诱导因子基因后，可以进行大量的研究。
我在霍普金斯大学做了两年博士后，然后做了一两年助理研究员，然后去了公司工作。我仍然希望缺氧诱导因子可以作为寻找治疗药物的靶点。我希望至少可以建立乳腺癌或前列腺癌的肿瘤模型。当时，是在20世纪90年代末，对缺氧诱导因子的理解还不是很深。我最初的项目没有实施，但在那之后，我仍然在公司工作，开发新药。
已经20年了。在此期间，不仅我导师的实验室，而且许多其他实验室都做了大量的工作。现在他们对这种方法的机理有了相当多的了解。许多制药公司也将缺氧诱导因子作为药物筛选和开发的目标，这非常受欢迎。
给我印象最深的是在冷库里做实验。
“知识分子”:当时你为什么选择去塞门扎教授的实验室进行博士后研究？
王广亮:霍普金斯大学是美国最好的医学院之一，我认为这个话题非常有意义，因为氧是细胞功能的基础。当时，塞门扎教授刚刚在霍普金斯大学完成博士后研究。他是一名医生和科学博士，非常聪明。平时他要接待病人、教书和做科学研究，所以我主要做实验室工作。我喜欢在实验室和他一起工作。
这项工作最令人印象深刻的是，当纯化缺氧诱导因子转录因子时，因为蛋白质不能失活，所以整个工作需要在低温下进行。柱筛选步骤在冷库中进行。我总是穿厚衣服和白大衣，这让我看起来很胖。事实上，我很瘦。离心机、色谱柱、试管和其他物品被放置在4摄氏度以下的冷库中。我每天在里面呆很长时间，天气太冷了，不能出来取暖，然后再进去。
单克隆抗体克隆
塞门扎在中国南方科技大学学术交流期间的PPT照片。图中的数字是塞门扎实验室时期的王广亮和最近的王广亮。这张照片是由受访者提供的。
两位中国学者参加了重点论文。
知识分子:我想报纸上还有另一位作者，他的名字叫姜伯赫？他也是中国人吗？
王广亮:是的，他是中国人。他的中文名字是江花冰。他后来进入实验室，对缺氧诱导因子基因的功能做了大量的工作，如缺氧诱导因子对血管内皮生长因子的调节功能，这证实了克隆的蛋白确实在细胞中发挥了作用。
我是塞门扎教授的第一个博士后研究员，江是他的第二个博士后研究员，并参与了后来的克隆工作。另一个是我们的实验室技术员。那时，实验室里只有我们四个人。当我刚加入时，塞门扎教授刚刚成为助理研究员，资金不是很大。他的博士后老板非常支持，当时我们用大老板的实验室做了很多仪器设备。我们还使用了其他教授的仪器和设备。
我的导师非常致力于科学，他的研究重点是缺氧诱导因子基因。
“知识分子”:如果你在大老板的实验室里做，中国的报纸上也可能有大老板的名字。这篇PNAS论文只有你实验室四个人的名字？
王广亮:是的。事实上，大老板并没有具体参与这项工作，但我特别感谢报纸上提供帮助的许多人。在塞门扎教授写的与拉斯克奖相关的CELL文章中，他把我的照片放在中间，旁边还放了许多人的照片，包括他的导师，现在是霍普金斯大学负责科学研究和国际合作的副校长。那时，他是我的实习生和同事。
单克隆抗体克隆
缺氧信号通路在健康领域的潜在应用
知识分子:基于你的研究，第一种治疗贫血的新药在中国被批准了吗？
王广亮:这种药物是由另一家以缺氧诱导因子蛋白修饰酶为靶点的公司制造的，但也表明缺氧诱导因子可以成为药物开发的新靶点。我主要从事医药公司肿瘤、眼科和精神药物的开发，希望能在高强度聚焦超声中找到新的应用。
知识分子:缺氧信号通路的研究如何影响我们的生活？
王广亮:缺氧信号通路有许多潜在的应用。例如，促进促红细胞生成素的表达可以治疗贫血，其作用是稳定缺氧诱导因子的功能。几年前，我还试图通过抑制缺氧诱导因子功能来治疗肿瘤，如乳腺癌。这种药物仍在开发中。
对于肿瘤，不受控制的肿瘤细胞会形成细胞团，细胞团内部缺氧，但由于毛细血管可以进入，为肿瘤细胞提供营养。因此，如果缺氧诱导因子的功能被阻断，毛细血管不允许进入，肿瘤细胞团将坏死。目前，血管内皮生长因子是已知的治疗靶点，市场上有许多药物。血管内皮生长因子受缺氧诱导因子调节，其他与细胞生长相关的因子如PDGF(血小板衍生生长因子)也受缺氧诱导因子调节。因此，如果缺氧诱导因子被阻断，肿瘤可以从上游治疗，效果会更好。此外，我们还发现了一些抑制缺氧诱导因子功能的小分子化合物。与目前市场上针对血管内皮生长因子的蛋白质药物相比，小分子化合物的价格将会低得多。缺氧诱导因子具有多种功能，还能抑制肿瘤干细胞的生成和肿瘤对某些化疗药物的耐药性。
此外，年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变都是由眼睛血管的异常生长引起的。糖尿病或在黑暗环境中长时间看手机会导致视网膜极度缺氧和缺氧诱导因子过度表达，诱导血管异常生长，并对视网膜形状和功能造成损害。抑制缺氧诱导因子使血管萎缩的方法可能能够治疗年龄相关性黄斑变性和视网膜病变。这也是我们现在正在研究的一个领域。
在心血管疾病中，心肌梗塞、血流不畅引起的下肢瘫痪和肺动脉高压都与血流和供氧有关。心肌梗塞最为明显，因为血管阻塞，心肌细胞因缺氧而坏死。因此，开发能够立即恢复心肌细胞功能的药物非常重要。此外，目前一些公司已经通过缺氧诱导因子基因治疗改善了下肢血流不畅患者的血流和供氧。
综上所述，我们的工作在贫血、肿瘤、眼科和心血管疾病方面有很大的应用价值。我离开霍普金斯大学是为了开发对病人有用的药物。当然，当时还比较早，进展也比较慢。目前，一些药物已进入临床后期。
知识分子:缺氧诱导因子调控的血管内皮生长因子药物在临床上成功应用了吗？
王广亮:是的，血管内皮生长因子是我们刚刚提到的血管内皮生长因子，这是一个非常成功的目标。许多单克隆抗体药物针对它。血管内皮生长因子的作用范围相对狭窄，所以其他方面的影响相对较小，所以更容易制成药物。然而，缺氧诱导因子的功能比缺氧诱导因子的功能要广泛得多。血管内皮生长因子只是缺氧诱导因子调节的因素之一。至少有5-6种生长因子与血管生长和分化相关。
目前市场上销售的单克隆抗体药物，如阿瓦斯丁，通过抑制血管内皮生长因子来治疗肿瘤或眼病，具有很大的益处。然而，它并不是对所有病人都有用。血管内皮生长因子的作用可能只有40%-50%，50%-60%来自其他5-6种生长因子的作用。因此，单独抑制血管内皮生长因子对所有肿瘤和年龄相关性黄斑变性并不有效。此外，由于生理补偿的存在，靶向血管内皮生长因子的治疗效果随时间逐渐降低。这是因为当血管内皮生长因子被抑制时，其他几种生长因子的表达增加。
因此，如果缺氧诱导因子是靶向的，缺氧诱导因子调节下游的所有生长因子都将被抑制。因此，聚焦超声具有更广泛的应用。根据原则，疗效应该更好。当然，还需要进一步核实。
运气是因为做事专心致志。
知识分子:当时做研究的时候，你认为相关工作会获得诺贝尔奖吗？
王广亮:当时我不这么认为，但后来我认为这是一个非常重要的发现。这项工作仍然归功于霍普金斯大学良好的研究环境和条件，为我们的项目提供了很多支持。
知识分子:当你在塞门扎实验室做相关研究时，你有竞争对手吗？
王广亮:是的。三个实验室同时获得了诺贝尔奖。事实上，获奖实验室的工作是基于我在霍普金斯大学所做的缺氧诱导因子基因克隆工作。当然，在那之后，他们做了一项非常彻底和非常重要的工作。
当时，英国实验室也在寻找克隆方法，这和我在霍普金斯大学实验室必须做的一样，但他们的方法不同于我们的，最后我们先做了。那时，我们也有很多交流。他们认为我的克隆方法不太可能实现，因为细胞中的因子非常小。通过培养大量细胞以及测序和筛选基因来纯化该因子是太多的工作。但是我们还是一步一步地做，从1992年初到1993年，基因被克隆，论文于1995年发表。我使用的方法确实有很多工作。我需要从从几个培养振荡罐中获得的数百升细胞培养液中纯化几微克，也就是说，一个小试管底部的一点东西。如果我不小心弄丢了，我将不得不重新开始。我的运气很好。我从头到尾都做得很顺利。我没有使用错误的试剂、扔掉样品或使样品失活。事实上，好运主要是由于这样一个事实:在开始的时候，我是如此专心致志地做事情，以至于我认为这份工作非常有意义。
现在从事药物研发
知识分子:你离开约翰·霍普金斯大学后做了什么？
王广亮:我希望我能在药物开发领域做些工作，但是药物开发需要多年的投资和大量的资金。当然，主要原因是对缺氧信号通路和缺氧诱导因子的作用机制还没有深入的了解，所以虽然我们筛选了许多先导分子，但进展仍然相对缓慢。但是这些工作非常重要，我希望我能在应用领域做点什么。现在有很多人在做这件事，不管谁能做，不管哪家公司，不管这件事和我有没有关系，我都会很高兴，因为毕竟这是为了病人的利益。
几年前，我回到中国，希望能找到一项投资，但一直没有实现。因为开发新药至少需要五到十年的时间和上亿的投资，但在中国很少有人能真正投资开发新药。他们中的大多数也是我和我的代表，也就是说，他们可以在他人的基础上做出一些改进或做一些不同的事情。然而，对于缺氧诱导因子来说，它是一流药物开发的新靶点和新机制，风险仍然相当高。
我认为诺贝尔奖的颁发是一个加强该领域目标研究的机会。也许我会在未来找到更有说服力的投资。
知识分子:现在和塞门扎教授有联系吗？
王广亮:是的。几年前，我带他到中国成立了一家开发药品的公司。他愿意这样做。我们已经在杭州成立了一家公司。然而，资金并没有到位，我们最终也没有落实，这是一个遗憾。从那以后，贸易战开始了，国际交流可能会出现问题。
我的导师认为我们的工作在基础研究中非常重要。当然，如果我们开发应用价值，我们将帮助更多的人。目前，所列的贫血治疗药物不是我们自己制造的，但它们已经证明了缺氧诱导因子的许多潜在应用价值，是一个非常重要的研究领域。这也可能是他这么早就获得诺贝尔奖的原因。我原本以为，在肿瘤治疗相关药物问世之前，我可能不会获奖。毕竟，它的贡献不能局限于基础研究，而应该能够真正有益于人类健康。简而言之，无论是我们自己做还是其他公司做，都是非常有意义的。
单克隆抗体克隆
知识分子:你的专利被授权给一些公司了吗？
王广亮:大约在1998年我们获得了克隆缺氧诱导因子基因的专利，现在这个专利已经过期了。后来的专利属于开发药物的公司。现在基本上每个人都能做到，而且可能没有任何专利限制。
知识分子:回顾20多年前，相关工作为今年的诺贝尔奖奠定了基础。最后，你还有什么想和我们分享的吗？
王广亮:我来自浙江天台村。山区的条件起初很差。后来，我目睹了国内改革开放的成就。我认为我的科学研究经验仍然很有意义。特别是目前，中国非常重视医药领域，并在医药领域投入了大量资金，希望看到真正的新的、好的药物出现。
知识分子:顺便问一下，你什么时候出生的？
王广亮:今天只是我的生日！这是给我的一份非常好的生日礼物。1963年9月9日，重阳节是我的生日。我的护照上写着公历10月10日。
知识分子:你还没有联系塞门扎，是吗？
王广亮:我刚刚给他发了一封电子邮件，祝贺他获得诺贝尔奖。
知识分子:他不知道今天是你的生日，是吗？
王广亮:他不知道。他认为我在10月10日拿到我的证书。只有我的家人知道我的农历生日。
知识分子:祝贺你，生日快乐！
王广亮:谢谢你！总之，这项工作有我们中国人的参与和贡献，也是一件非常有意义的事情。
