大自然的重磅炸弹:科学家首次发现影响CRISPR基因编辑技术体内修复效率的关键因素

今天是2018年8月1日

农历6月20日

医疗Macs: CRISPR有许多可能性

2年8月1日018/Medical Macs eMedClub/ -尽管人们对CRISPR-Cas9基因编辑有很高的期望，并已进行了大量投资，但科学家仍不知道它在人体内是如何工作的。< br>

在最近的一项研究中，加州大学伯克利分校的科学家发现，范可尼贫血途径是调节CRISPR修复效率的关键。这项研究发表在7月27日的《自然遗传学》网络版上

的科学家解释了CRISPR-Cas9基因编辑后细胞如何修复DNA，以及这一新的研究结果如何影响基因组编辑的发展。《

(视频来源:伯克利)

》的作者雅各布·科恩教授说:“基因编辑非常强大，有很大的希望，但迄今为止，也有很多实验和错误。”它在人类细胞中的工作方式一直是一个有许多假设的黑箱。现在，我们终于开始明白发生了什么。“

”的发现探究了为什么CRISPR-Cas9基因编辑没有在所有细胞中获得同样的成功。它可以帮助研究人员提高将新的DNA插入基因组的效率，例如，用正确的DNA序列替换有害的突变，以及调整CRISPR-Cas9的编辑以获得期望的结果。

CRISPR依赖于DNA修复

CRISPR-Cas9是革命性的，因为它可以精确地利用基因组中数十亿个特定的DNA序列并切割双链DNA分子但之后，细胞修复损伤。

CRISPR原理(图片来源:Brain ASK)

双链断裂的修复(DSB)可以通过两种方式进行:

-非同源末端连接(NHEJ)，这不需要DNA模板，似乎是CRISPR切割后最常见的结果；

-同源定向修复(HDR)在某些类型的细胞中比在其他细胞中更频繁地发生，并且需要可用于修复DSB的DNA片段来替换错误的序列。

然而，这两个过程都有些神秘。没有人知道为什么有些细胞可以很容易地用DNA修复，而其他细胞却很少这样做。

此外，同源定向修复(HDR)可分为同源重组修复和单链模板修复(SSTR)，其DNA供体分别是双链DNA(dsDNA)(线性和质粒)和单链寡脱氧核苷酸

在大多数细胞类型中，来自dsDNA供体的修复效率相对较低，并且假设使用类似于减数分裂同源重组的修复机制。相反，SSTR是高效的(> 20%等位基因)，在后生动物中广泛保守

筛选平台的建立:CRISPR介导的SSTR途径的检测

当筛选人类癌细胞系时，研究人员发现在给定基因座以SSTR为主要成分的基因组编辑可以从完全无效(0% SSTR)到非常有效(30% SSTR)不等，这取决于细胞背景这意味着不同背景下基因或转录的差异可以上调或下调基因编辑。因此，研究人员决定检测与CRISPR-Cas9介导的SSTR相关的途径。

首先，他们开发了一个耦合抑制编辑筛选平台，该平台可以检测人类细胞中的各种编辑结果，将CRISPR RI CA S9编辑基因的数千个单拷贝与蓝色荧光蛋白(BFP)报告基因的基因组整合结合起来筛选池中的每个细胞都稳定表达dCas9-KRAB CRISPRi构建体和靶向转录起始位点基因的gRNA然后用预制品核转染该池，包括靶向碱性成纤维细胞生长因子报告基因的Cas9-gRNA RNP复合物和编码3-bp密码子的ssODN，以将碱性成纤维细胞生长因子转化为绿色荧光蛋白(GFP)报告基因

然后，通过荧光激活细胞分选(FACS)分离编辑的细胞，并将其分为未编辑(BFP+/GFP-)、插入删除(BFP-/GFP-)和SSTR编辑(BFP-/ GFP+)接下来，Illumina测序被用来比较哪些靶基因促进(在编辑的细胞中下调gRNA)或限制(在编辑的细胞中富集gRNA)特定的基因组编辑

编辑细胞筛选机制

Fanconi途径在SSTR修复

中起关键作用为了确定Cas9介导的SSTR所需的因子，研究人员使用流式细胞仪分离GFP+细胞并测量它们相对于未分类编辑细胞的gRNA丰度在

的结果中，最引人注目的是，与未分类的编辑细胞相比，70% (28/40)的Fanconi途径(FA)中的基因在GFP+细胞中强烈缺失。因为Fanconi途径(FA)以前被认为是一种修复系统，对Cas9介导的基因组编辑不重要，通常被认为是一种链间交联反应，而不是核酸酶诱导的切割。本研究中对生物基因的丰度分析也证实了DNA修复，尤其是FA途径是SSTR的一个决定性特征。

FA途径与Cas9介导的基因组编辑密切相关。

FA修复途径的多种成分在SSTR

和范可尼途径

中起作用。该途径涉及21种不同的蛋白质，因为如果编码这些蛋白质的任何基因被破坏，就会发生范可尼贫血，这是一种罕见但严重的遗传疾病，并且患者的骨髓不能产生足够的血细胞。这种疾病伴随着出生缺陷和癌症的高风险。儿童白血病的发病率为10%，很少有患者活到30岁以上。

这一途径已为人所知并研究了几十年，但一般认为它能修复一种特殊的DNA损伤:DNA链间交联，即一条DNA链上的核苷酸与相邻链上的核苷酸紧密结合，干扰DNA复制并经常杀死细胞

FA途径调节NHEJ和SSTR之间的平衡

接下来，研究人员编辑了导致镰状细胞病的血红蛋白亚基β(HBB)基因座(Glu6Val)。他们发现所有七个FA因素对于SSTR的编辑都是必要的值得注意的是，FA基因的敲除降低了SSTR水平，提高了NHEJ水平，最终主编水平保持相对稳定。

当编辑没有ssODN的HBB基因座时，FA基因敲除并没有显著增加NHEJ频率，当编辑BEP基因座时得到类似的结果这表明足总的方法并不影响NHEJ

此外，在人类成纤维细胞的基因编辑中，SSTR在FA修复途径中被siRNA击倒的FANCA或FANCE减少了约5倍

FA通路与SSTR

显著相关。在没有ssODN的情况下，FA修复通路既不影响总频率也不影响插入损失的方式相反，当用ssODN编辑时，当FA修复途径被干扰时，SSTR显著降低。

总之，FA通路只在SSTR修复和NHEJ与SSTR之间的平衡中起作用，而在易错终端连接通路中没有直接作用(NHEJ)

托SSTR依赖于FA基因下游的特定亚复合物

FA基因通常依赖于特定亚复合物来维持基因组稳定性，其中一些是解旋酶，包括布鲁姆综合征蛋白(BLM)和3’-5’DNA POLQ样解旋酶(HELQ)来抵抗异常染色体结构和复制应激。

因此，研究人员发现BLM通过击倒BLM和赫尔辛基委员会对SSTR没有影响，但是赫尔辛基委员会可以显著影响SSTRHELQ还可以与BCDX2重组子丛(RAD51B、RAD51C、RAD51D和XRCC2)相互作用，但独立于CX3子丛(由RAD51C和XRCC 3组成)这些复合物可以促进ssODN和基因组DNA之间的重组。因此，研究人员还研究了这些复合物是否会影响SSTR。他们发现RAD51C对SSTR是必要的，但RAD51B和XRCC2不是这表明BCDX2综合体在SSTR不工作。相比之下，RAD51C和XRCC3都是SSTR所要求的，这表明CX3子丛在SSTR发挥了作用。

的未来工作应该发现FA途径如何与聚合酶相互作用和基因介导重组，这可能为SSTR机制及其与其他维持基因组稳定性的方式的相互作用提供有价值的见解。

FAA途径的核心成分

位于由Cas9介导的双链断裂位点

FANCD2。FAncd2是fa途径的核心参与者，其可以在链间交联和紫外线损伤期间被检测到。因此，研究人员使用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)来确定FANCD2的全基因组定位，以响应Cas9编辑。

令人惊讶的是，在几个细胞上进行了基因编辑，包括K562(慢性髓性白血病细胞)和HEK293(人胚胎肾上皮细胞)。发现FANCD2在已编辑的目标站点(在目标上)显示大量浓缩，在非目标站点显示非常少的浓缩，并且在未报告的非目标站点没有浓缩

基于此，研究人员提出了一个模型，即FANCD2可以位于Cas9编辑的双链断裂位点这可能是通过残基Lys561的单泛素化激活下游来控制下游修复的结果这也表明FANCD2在CRISPR-Cas9基因编辑的调控中起着重要作用。

fancd 2位于双链断裂位点

(apo:Cas9 alone nrp:Cas9+单导向RNA RNP+供体:Cas9+RNP+sdn)

FA通路作为交通信号

，其活性水平或影响CRISPR-Cas9效率末端连接是DNA双链断裂后的默认修复机制，但FA途径与之竞争，更高的活性将导致更多的同源定向修复(HDR)和更少的末端连接。因此，FA途径的活性水平可能影响CRISPR将DNA插入特定细胞的效率

FA通道作为交通信号

。其次，FANCD2是该途径中的21种蛋白质之一，它总是位于CRISPR-Cas9产生的双链断裂位点，这意味着通过同源定向修复(HDR)调节FANCD2的表达来增加细胞插入DNA的频率是可能的。此外，基因编辑靶和靶外切割位置可以通过绘制基因组中FANCD2的位置来找到。

然而，脂肪酸途径在CRISPR骨折修复中的重要性引起了对某些使用HDR修复的CRISPR疗法的怀疑。因为没有活性的FA途径，细胞在Cas9裂解后可能无法通过HDR修复用正常基因替换它们的突变基因。

和更具前瞻性的是，FA途径相关因子的表达水平可用作患者细胞“可编辑性”的生物标记，并且增强FA途径的活性在治疗难以编辑的细胞中可能特别有价值。

资料来源:

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